MicroRNAs（miRNAs）作为非编码的小分子RNA，在细胞生长、分化、增殖和凋亡等过程中发挥关键作用。在血液和癌细胞系中作为癌症诊断生物标志物具有巨大潜力，尤其是在乳腺癌中的异常表达对诊断、发病及治疗干预有重要意义。然而，传统的miRNA检测方法如Northern blot存在灵敏度不足、需要大量样本等局限性，而现有的CRISPR/Cas系统在临床诊断中的应用也面临一些挑战，如依赖热循环的PCR方法操作复杂、等温扩增方法存在背景信号高和特异性低等问题。因此，开发一种快速、灵敏、特异且操作简便的miRNA检测方法具有重要意义。

1）LRPA-CRISPR检测miRNA-21的原理

图1描述了LRPA-CRISPR检测miRNA-21的原理。在miRNA-21存在的情况下，利用T4 DNA连接酶将两个DNA探针快速、特异、高效地连接在miRNA-21上。引入DNA聚合酶，在RNA/DNA双链中扩增DNA链并释放miRNA，从而防止在随后的反应中暴露于Cas12a反式切割。同时，miRNA-21可以进一步与新探针杂交，激活下一轮T4 DNA结扎反应，并提供靶循环激活的信号放大。DNA聚合酶促进正向引物和反向引物在两个方向上的延伸，从而产生dsDNA扩增子。Anti-Mango-crRNA被完整编程的dsDNA扩增子转录，并在Cas12a蛋白的加工下加工成熟的crRNA，为Cas12a顺式切割反应提供支持。通过同时连接高度特异性的crRNA识别序列，扩增的dsDNA扩增子能够触发CRISPR/Cas12a的靶向顺式切割活性。同时，切割的dsDNA扩增子在T7 RNA聚合酶的作用下转录生成Mango RNA用于信号输出。Mango RNA适配体与TO1 -生物素荧光团之间具有高亲和力，丰富的功能性Mango RNA的转录达到了显著的信号放大。通过编程miRNA-21的探针序列，LRPA-CRISPR可以在等温方式下检测其他类型的microRNA。

             图1:LRPA-CRISPR法检测miRNA示意图

2）传感器可行性验证

将LRPA系统和Cas12a顺式切割系统诱导的程序化转录进行级联，验证LRPA-CRISPR实验的整体可行性（图2A）。通过凝胶电泳验证miRNA-21触发LRPA系统的识别（图2B），表明miRNA-21可以触发Mango探针和Anti-Mango探针在lane 6组装稳定的三联物，T4 DNA连接酶高效地进行Mango探针和Anti-Mango探针的连接。dsDNA扩增产物加入了RPA反应体系，验证了等温扩增反应的有效性。Cas12a顺式切割系统在lane 3中产生功能性Mango RNA，而lane 2只产生Anti-Mango RNA(图2C)。同时，实验组荧光强度显著增加，而其他组无明显变化（图2D）。

图2：(A) Cas12a顺式裂解体系示意图。(B)连接识别触发RPA系统的10% PAGE验证。(C) Cas12a顺式裂解激活体系的10% PAGE验证。(D)典型荧光反应对LRPA-CRISPR检测的验证。

实际样本检测

研究LRPA-CRISPR单步检测miRNA在癌症鉴定和预测中的可行性。在乳腺癌患者血浆和细胞样本中，该方法成功检测到了miRNA-21的表达水平（图6A），并且与实时荧光定量PCR（RT-qPCR）的结果高度一致。从四种不同的细胞系中获得样品，定量miRNA-21水平，与MCF-10A细胞系样本相比，HepG2、MCF-7和HeLa细胞系样本中的miRNA-21水平显著升高（图6B）。从乳腺癌患者和健康对照者的血浆样本中分离总RNA用于定量miRNA-21，实时评估荧光强度，在乳腺癌患者样本中观察到的荧光信号强度超过了健康个体的样本（图6C和D）。

图6.所示。一锅法检测临床样品中miRNA的临床应用。(A)使用RT-qPCR和本方法测量的人血浆样品和细胞样品中miRNA检测步骤示意图。(B) RT-qPCR检测HepG2、MCF-7、HeLa和MCF-10A细胞系中提取的miRNA-21与该方法在生物传感中的应用比较。(C)使用RT-qPCR和本方法测量的miRNA-21浓度荧光信号水平的热图。(D)采用该方法（蓝色）和RT-qPCR（黑色）分析患者和健康样本中miRNA-21的表达水平。数据以均数±标准差表示（n = 3）。

 文章总结了一锅法LRPA-CRISPR荧光生物传感器作为一种快速、灵敏、特异且操作简便的miRNA检测方法，具有显著的优势。它不仅提高了检测的灵敏度和特异性，还大大简化了检测流程，降低了检测成本，为miRNA的临床诊断提供了一种新的策略。然而，作者也指出，尽管该方法在科学实验和临床应用中表现出良好的性能，但荧光RNA适配体基生物传感器仍需要特定的光谱分析，限制了其在临床诊断中的大规模应用。

 创   新   点：

一锅法检测平台：将重组酶聚合酶扩增（RPA）与CRISPR/Cas12a顺式切割系统相结合，开发出一种一锅法荧光生物传感器，实现了miRNAs的检测。这种一锅法设计避免了传统方法中多个独立的预扩增和CRISPR介导的信号输出步骤，大大简化了实验流程，缩短了检测时间。

自供crRNA机制：利用Cas12a的前crRNA处理活性，将由完整dsDNA扩增子转录的Anti-Mango-crRNA加工成熟crRNA，实现了crRNA的自供应，提高了检测的效率和特异性。

顺式切割机制的应用：以往的CRISPR/Cas12a诊断方法多依赖于反式切割进行信号放大，但容易导致假阳性。而本文利用Cas12a的顺式切割机制，结合转录扩增策略，生成功能性Mango RNA，实现了信号输出，避免了反式切割带来的假阳性问题。

无标记检测：该方法无需对miRNA进行标记，降低了检测成本，提高了检测的通用性和便捷性。

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