即便久未开展Western blot实验，只要手头有一份完整可靠的实验方案（Protocol）及注意事项，且其中包含详尽的细节提示，就能确保随时能重新上手操作，尽可能减少失误甚至避免出错，进而提高WB实验的成功率。

实验步骤：

1.收细胞：分选后或培养中的细胞，4℃，500g，离心5分钟，弃上清，PBS洗2遍。

2.裂细胞：振荡开细胞沉淀后，加入含终浓度为1mM PMSF（原液100x）的Western及IP裂解液或者RIPA裂解液（强），现配现用，冰上静置10-20分钟裂解细胞。

3.收上清：提前预冷离心机，4℃，14000g，10分钟，移液枪吸取上清到新的冰上预冷的1.5mL离心管中。

4.测浓度：取原液或稀释后，通过BCA法测定样品的蛋白浓度（可选）。

5.煮蛋白：取一定体积的蛋白上清液，加入5×蛋白上样缓冲液稀释，充分混匀后，金属浴95-100℃或水浴煮10分钟，将样品置于冰上降温，瞬离后于-80℃冰箱保存备用。

6.制胶：根据目的蛋白大小，制备10%或12%浓度的SDS-PAGE蛋白胶，配制下层分离胶（试剂及配方见后），将其加注到玻璃夹板内。随后，用移液枪取无水乙醇进行液封，操作时枪头需平行贴住玻璃板，匀速缓慢加入。与水液封相比，无水乙醇液封的优势在于：能快速去除分离胶最上层的小气泡；且加分离胶前不易残留液体，可避免因液体残留导致的胶面不均匀及横向溢漏问题。静置20-30分钟，待下层分离胶凝固后，倒掉液封用的无水乙醇，用卫生纸吸附残余乙醇，再静置片刻，确保乙醇完全挥发干净。配制上层浓缩胶（试剂及配方见后），将其沿玻璃板边缘加注，直至合适高度。接着插入梳子，注意梳子需清洗干净并擦干。插入时，先从左侧将梳子放入，再缓慢下压，直至右侧卡入固定。

7.上样：取出玻璃板，用跑胶夹板固定好。倒入1×电泳液以起到润滑作用，确保电泳液浸没梳子及玻璃边缘后，双手保持平行，轻轻拔出梳子。随后，用1ml移液枪吹拂每个上样孔的边缘及内部，避免残留的细碎胶堵塞上样孔而干扰上样。取对应体积的蛋白样品加入SDS-PAGE蛋白胶的上样孔中，操作时需对准上样孔正中央匀速加入，注意防止样品溢出。

8.跑胶：浓缩胶阶段设置电压为80V，电泳约20-30分钟，直至观察到样品在浓缩胶底部拉平。分离胶阶段调整电压至120V，电泳时间需根据目标蛋白大小确定，可通过观察彩色Marker及所需分离效果，运行40-120分钟。注意分离胶最下层边缘通常不均匀，后续转膜时需将该部分裁切掉。

9.转膜：PVDF膜0.22或0.45μm，裁剪到5x8cm基本上可以铺满整张蛋白胶，按实际需求分子量裁剪，需要标记一般裁剪右上角或者铅笔写字。PVDF膜转膜前需要先完全浸没甲醇中激活30s左右，再浸没到干净的水中。通过转膜仪将SDS-PAGE胶上的蛋白湿转至PVDF膜上，90V或300mA，1.5-2小时；按照待检测最大分子量蛋白，每1kDa转1分钟，可适当延长确保大蛋白的转膜效果。

10.封闭：PVDF膜含蛋白的那一面朝上放。转膜完成后0.1%PBST先润洗一遍PVDF膜。再用5%脱脂奶粉（用0.1%PBST配制），室温，孵育1小时。脱脂奶粉一定要摇匀，不要有未溶解的渣点点。

11.一抗：用一抗稀释液或者5%脱脂奶粉稀释目标抗体，合适比例，4℃，孵育过夜。如果是内参蛋白，室温孵育1小时先做也行。0.1%PBST洗3遍，每次5分钟。

12.二抗：用二抗稀释液或者5%脱脂奶粉稀释HRP标记的Anti-Mouse或者Anti-Rabbit二抗，室温，孵育1小时。0.1%PBST洗3遍，每次5分钟。

13.显影：配制ECL发光液，1:1，现用现配。滴加到PVDF膜上浸没，曝光仪显影成像。

14.计算：计算条带灰度值，和内参比较目的蛋白的相对表达水平。

所有用到的试剂和抗体：